Kwaśna fosfataza prostaty – od biologii prostaty do kryminalistycznego wykrywania śladów nasienia

Kwaśna fosfataza gruczołu krokowego należy do grupy enzymów, których znaczenie wykracza daleko poza ich pierwotną rolę biologiczną. W organizmie człowieka jest ona przede wszystkim produktem wydzielanym przez gruczoł krokowy i jednym z charakterystycznych składników płynu nasiennego.

W przeszłości substancja ta była przez wiele lat stosowana jako marker chorób prostaty, zanim powszechnie zaczęto stosować antygen specyficzny dla prostaty (PSA). W kryminalistyce fosfataza kwaśna prostaty zachowała jednak inną i niezwykle trwałą rolę: od ponad siedemdziesięciu lat jej aktywność jest wykorzystywana jako ważny marker biochemiczny w wstępnym wykrywaniu śladów, które mogą zawierać nasienie. Jej przydatność wynika z wyjątkowo wysokiej aktywności enzymatycznej występującej w wydzielinach prostaty, co oznacza, że nawet stosunkowo niewielkie ilości materiału biologicznego mogą, w odpowiednio zaprojektowanych warunkach reakcji, wywołać łatwo obserwowalną reakcję chemiczną.

Właściwość ta stała się podstawą klasycznych kryminalistycznych testów na fosfatazę kwasową i stanowi również zasadę biochemiczną wykorzystywaną przez urządzenie StripDetective. Kwaśna fosfataza prostaty jest jednak białkiem znacznie bardziej interesującym, niż mogłoby to sugerować jej zastosowanie jako prostego markera analitycznego. Jest to enzym glikozylowany o złożonej strukturze trójwymiarowej, należący do rodziny fosfataz kwasowych histydynowych, zdolny do hydrolizy szerokiego zakresu związków zawierających fosforan, a jego pełna rola fizjologiczna w płynie nasiennym nadal nie została w pełni wyjaśniona. Zrozumienie jego struktury molekularnej i właściwości enzymatycznych pomaga wyjaśnić, dlaczego jego aktywność od dziesięcioleci pozostaje tak przydatna w wstępnym badaniu nasienia.

Od enzymu diagnostycznego do markera kryminalistycznego

Historia fosfatazy kwaśnej prostaty jako markera biologicznego rozpoczęła się jeszcze przed jej powszechnym zastosowaniem w kryminalistyce. W pierwszej połowie XX wieku naukowcystwierdzili, że aktywność tego enzymu jest silnie powiązana z gruczołem krokowym i może wzrastać w niektórych stanach patologicznych. Fosfataza kwaśna prostaty stała się następnie jednym z najważniejszych markerów biochemicznych stosowanych w diagnostyce i monitorowaniu raka prostaty, zanim jej rolę w znacznym stopniu zastąpiło badanie poziomu PSA. Jednocześnie naukowcy zaobserwowali wyjątkowo wysoką aktywność tego enzymu w ludzkim płynie nasiennym. Cecha ta szybko przyciągnęła uwagę kryminalistów poszukujących szybkich metod chemicznych umożliwiających identyfikację plam nasiennych, których nie zawsze można było rozpoznać gołym okiem.

W latach 40. XX wieku w publikacjach zaczęto opisywać wykorzystanie aktywności fosfatazy kwaśnej do identyfikacji plam nasiennych. W 1949 roku Sidney Kaye opublikował artykuł zatytułowany „Test fosfatazy kwaśnej do identyfikacji plam nasiennych”. Już w kolejnej dekadzie metoda ta ugruntowała swoją pozycję na tyle, że naukowcy opracowali stabilne paski odczynnikowe, które umożliwiły przeprowadzanie testów fosfatazy kwasowej poza tradycyjnym środowiskiem laboratoryjnym. Od tego czasu kryminalistyka uległa radykalnym zmianom: dostępne stały się testy immunologiczne, zaawansowana mikroskopia, profilowanie DNA oraz szeroki wachlarz metod molekularnych. Niemniej jednak badanie fosfatazy kwaśnej zachowało swoją wartość jako szybka metoda wstępnego badania przesiewowego, ponieważ opiera się na autentycznej i wysoce charakterystycznej właściwości biochemicznej płynu nasiennego.

Czym dokładnie jest kwaśna fosfataza prostaty?

Fosfataza kwaśna gruczołu krokowego, najczęściej określana skrótem PAP (od ang. Prostatic Acid Phosphatase), jest enzymem należącym do grupy fosfataz kwaśnych. Skrót PAP pojawia się również często w literaturze naukowej. Białko to jest kodowane przez gen oznaczany obecnie jako ACP3, choć w starszych publikacjach nadal bardzo powszechnie stosowany jest poprzedni symbol genowy ACPP. Gen ten znajduje się na długim ramieniu chromosomu 3, w regionie 3q22.1, i koduje białko prekursorowe składające się z 386 aminokwasów. Pierwsze 32 aminokwasy tworzą peptyd sygnałowy, który kieruje nowo zsyntetyzowane białko do szlaku wydzielniczego. Po usunięciu tego peptydu sygnałowego dojrzałe białko składa się z 354 aminokwasów.

Jeśli masę cząsteczkową dojrzałego polipeptydu obliczy się wyłącznie na podstawie jego sekwencji aminokwasowej, wartość ta wynosi około 41 kDa. W rzeczywistości jednak cząsteczka PAP jest cięższa, ponieważ ulega glikozylacji – modyfikacji potranslacyjnej, w ramach której do białka dołączane są struktury węglowodanowe. Dojrzała, glikozylowana podjednostka ma zatem masę cząsteczkową wynoszącą około 48–50 kDa. Dwie takie podjednostki łączą się, tworząc natywny homodimer o całkowitej masie cząsteczkowej wynoszącej około 100 kDa. To wyjaśnia, dlaczego w publikacjach naukowych PAP może być różnie opisywany jako białko o masie około 41, 50 lub 100 kDa. Wartości te nie są sprzeczne: odnoszą się one odpowiednio do dojrzałego łańcucha polipeptydowego, glikozylowanej podjednostki oraz kompletnego, funkcjonalnego dimeru.

Trójwymiarowa struktura enzymu

Kwaśna fosfataza prostaty ma dobrze scharakteryzowaną strukturę trójwymiarową. Każda z dwóch podjednostek tworzących dimer składa się z dwóch głównych domen. Większa domena ma architekturę α/β, z centralnym arkuszem β otoczonym helisami α, natomiast mniejsza domena składa się głównie ze struktur helikalnych α. W szczelinie między tymi domenami znajduje się miejsce aktywne enzymu, do którego musi przedostać się substrat zawierający grupę fosforanową. Precyzyjna geometria tej kieszeni ma zasadnicze znaczenie dla procesu katalizy, ponieważ zapewnia prawidłowe ustawienie grupy fosforanowej substratu względem kluczowych reszt aminokwasowych odpowiedzialnych za katalizę.

PAP jest również glikoproteiną. Zidentyfikowano trzy główne miejsca N-glikozylacji, które tradycyjnie określa się jako Asn62, Asn188 i Asn301, gdy za punkt odniesienia dla numeracji przyjmuje się białko dojrzałe. Jeśli natomiast numerację aminokwasów rozpocznie się od pełnego prekursora, te same pozycje odpowiadają Asn94, Asn220 i Asn333. Ta pozornie niewielka różnica ma znaczenie podczas zapoznawania się z literaturą naukową, ponieważ różni autorzy mogą stosować różne systemy numeracji, opisując dokładnie te same cechy strukturalne. Łańcuchy węglowodanowe przyczyniają się do stabilności i właściwości strukturalnych enzymu, wraz z konserwatywnymi resztami cysteiny oraz wiązaniami disiarczkowymi, które pomagają stabilizować dojrzałe białko.

PAP należy do rodziny fosfataz kwasowych zawierających resztę histydynową

Fosfataza kwaśna prostaty należy do nadrodziny fosfataz kwaśnych zawierających histydynę. Charakterystyczną cechą tej grupy jest wysoce konserwatywny motyw aminokwasowy RHGXRXP, zawierający resztę histydynową bezpośrednio uczestniczącą w katalizie. W dojrzałej ludzkiej fosfatazie prostatowej (PAP) jedną z najważniejszych reszt katalitycznych jest His12. Jej rola wykracza daleko poza zwykłe wspomaganie pozycjonowania substratu w miejscu aktywnym. Podczas katalizy grupa fosforanowa jest tymczasowo przenoszona z substratu na tę resztę histydynową, co prowadzi do powstania przejściowego produktu pośredniego – fosfohistydyny.

Ten kompleks fosfohistydyny ulega następnie hydrolizie, uwalniając fosforan nieorganiczny i przywracając enzym do stanu pierwotnego, dzięki czemu może rozpocząć się kolejny cykl katalityczny. W organizacji miejsca aktywnego bierze udział kilka dodatkowych reszt aminokwasowych, w tym Arg11, Arg15 i Arg79, których dodatnio naładowane łańcuchy boczne pomagają stabilizować ujemnie naładowaną grupę fosforanową wraz z His257 i Asp258. Asp258 bierze udział w organizacji środowiska katalitycznego oraz mechanizmu przenoszenia protonów, choć dokładny zakres jego roli był przedmiotem dyskusji w badaniach mechanistycznych. Reakcja przeprowadzana przez PAP jest zatem znacznie bardziej złożona niż zwykłe „odcięcie” grupy fosforanowej. Obejmuje ona przejściowe tworzenie kowalencyjnego półproduktu enzym–fosforan, co stanowi jedną z charakterystycznych cech mechanistycznych rodziny fosfataz kwasowych zawierających histydynę.

Jeden enzym, wiele potencjalnych substratów

Kwaśna fosfataza prostaty nie jest enzymem rozpoznającym wyłącznie jeden związek. Charakteryzuje się stosunkowo szeroką specyficznością substratową i jest zdolna do hydrolizy różnorodnych fosfomonoestrów. W badaniach laboratoryjnych jako substraty PAP wykorzystywano fosforan fenylowy, fosforan p-nitrofenylowy, fosfotyrozynę, fosfocholinę, AMP oraz kilka fosforylowanych pochodnych naftolu. Ta stosunkowo szeroka specyficzność ma istotne znaczenie zarówno dla zrozumienia funkcji fizjologicznych tego enzymu, jak i dla wyjaśnienia, w jaki sposób można go wykorzystać w chemii analitycznej.

Na szczególną uwagę zasługuje fosforan α-naftylowy, substrat wykorzystywany również w systemie reakcyjnym StripDetective. Badania kinetyczne ludzkiej fosfatazy kwaśnej prostaty wykazały korzystne właściwości enzymatyczne tego związku, w tym niską wartość Km w badanych warunkach, co wskazuje na skuteczne oddziaływanie między enzymem a substratem. Nie należy tego jednak interpretować jako dowodu na to, że fosforan α-naftylu jest związkiem naturalnym występującym w płynie nasiennym. Jest to syntetyczny substrat analityczny, celowo wybrany ze względu na to, że w wyniku jego hydrolizy enzymatycznej powstaje α-naftol, który może następnie uczestniczyć w drugiej reakcji chemicznej prowadzącej do powstania produktu o intensywnym zabarwieniu.

Jaką rolę faktycznie pełni fosfataza kwaśna prostaty w nasieniu?

Pełna rola fizjologiczna bardzo dużej ilości enzymu PAP obecnego w płynie nasiennym nadal nie została ostatecznie ustalona. Jest to nieco zaskakujące, ponieważ enzym ten jest znany od dziesięcioleci, jego struktura została szczegółowo scharakteryzowana, a jego aktywność jest stosunkowo łatwa do zmierzenia. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że PAP nie pełni jednej, wyodrębnionej funkcji, lecz bierze udział w kilku różnych procesach metabolicznych zachodzących w osoczu nasiennym oraz w środowisku biochemicznym otaczającym plemniki.


Jednym z najlepiej udokumentowanych substratów występujących w naturze jest kwas lizofosfatydowy (LPA). LPA to biologicznie aktywny lipid biorący udział w sygnalizacji komórkowej. Badania ludzkiej cieczy nasiennej wykazały, że enzym PAP może usuwać grupę fosforanową z LPA, co prowadzi do powstania monoacyloglicerolu. Wskazuje to, że enzym ten może przyczyniać się do regulacji stężenia lipidów sygnałowych w cieczy nasiennej, a tym samym może wpływać na jej lokalne środowisko biochemiczne.

Kolejnym szczególnie interesującym potencjalnym substratem fizjologicznym jest fosfocholina. PAP jest zdolny do hydrolizy fosfocholiny, w wyniku której powstają cholina i fosforan nieorganiczny. Jest to szczególnie intrygujące, ponieważ podczas ejakulacji dochodzi do połączenia wydzielin z kilku różnych gruczołów: pęcherzyki nasienne dostarczają związki zawierające fosfocholinę, natomiast prostata dostarcza bardzo duże ilości enzymu PAP. Cholina powstała w wyniku tej reakcji mogłaby następnie uczestniczyć w procesach regulujących funkcjonowanie plemników. Zaproponowano nawet model, w którym produkcja choliny za pośrednictwem PAP pośrednio przyczynia się do ruchliwości plemników poprzez cholinergiczne mechanizmy sygnalizacyjne. Pozostaje to raczej interesującą hipotezą fizjologiczną niż ostatecznie ustaloną podstawową funkcją PAP.

AMP, adenozyna i inne działania PAP

Zdolności enzymatyczne fosfatazy kwaśnej prostaty sięgają jeszcze dalej. PAP może pełnić funkcję 5′-nukleotydazy, katalizując hydrolizę AMP do adenozyny i fosforanu nieorganicznego. Aktywność ta została szczególnie dokładnie zbadana w odniesieniu do postaci transbłonowej PAP występującej w układzie nerwowym, gdzie lokalnie wytwarzana adenozyna może uczestniczyć w modulacji sygnalizacji bólu. Istnieje jednak znacznie mniej dowodów na to, że produkcja adenozyny stanowi główną funkcję bardzo wysokiego stężenia PAP występującego w płynie nasiennym.

Enzym ten wykazuje również aktywność wobec fosfotyrozyny i może brać udział w regulacji fosforylacji białek w komórkach prostaty. Wyniki te wskazują, że PAP należy traktować jako enzym o wszechstronnym działaniu biochemicznym, a nie jedynie jako marker konkretnego płynu ustrojowego. Różne formy tego białka mogą pełnić różne funkcje w zależności od ich lokalizacji komórkowej, dostępności określonych substratów oraz lokalnego środowiska chemicznego.

Formy sekrecyjne i transbłonowe białka PAP

Gen ACP3 może kodować więcej niż jedną formę białka. W przypadku kryminalistycznego wykrywania nasienia największe znaczenie ma forma wydzielnicza, określana zazwyczaj jako sPAP. Forma ta jest wytwarzana przez komórki nabłonkowe prostaty i uwalniana w dużych ilościach do płynu nasiennego. Jej wyjątkowo wysoka aktywność enzymatyczna stanowi podstawę klasycznych testów przesiewowych na obecność fosfatazy kwaśnej.

Istnieje również forma transbłonowa, znana jako TM-PAP, zawierająca dodatkowy region, który zakotwicza białko w błonie komórkowej. Zidentyfikowano ją również poza prostatą, w tym w obrębie układu nerwowego. PAP występuje również wewnątrzkomórkowo w komórkach prostaty, gdzie może brać udział w regulacji fosforylacji białek. Istnienie tych różnych form wskazuje, że biologiczne znaczenie ACP3 wykracza poza zwykłe wydzielanie enzymu do nasienia, chociaż z punktu widzenia medycyny sądowej forma wydzielnicza pozostaje najbardziej istotna.

Dlaczego fosfataza kwaśna jest tak przydatnym markerem kryminalistycznym?

W kryminalistyce użyteczny marker nie musi koniecznie występować wyłącznie w jednym rodzaju materiału biologicznego. Fosfataza kwaśna nie jest całkowicie specyficzna dla nasienia, ponieważ aktywność fosfatazy można wykryć również w innych tkankach i płynach ustrojowych. Tym, co wyróżnia płyn nasienny, jest skala aktywności enzymatycznej. Płyn nasienny charakteryzuje się szczególnie wysokim poziomem aktywności fosfatazy kwasowej, pochodzącej głównie z gruczołu krokowego, co pozwala na opracowanie testu chemicznego z progiem reakcji, przy którym wysoka aktywność enzymatyczna daje wyraźnie widoczny sygnał, podczas gdy typowe tło biologiczne pozostaje znacznie słabsze.

Jest to klasyczna koncepcja leżąca u podstaw markera wstępnego. Marker ten nie musi być absolutnie unikalny; musi natomiast występować w badanym materiale w stężeniu pozwalającym na jego znaczące odróżnienie od normalnego tła biologicznego . Z tego powodu badanie fosfatazy kwaśnej uznaje się za wstępną metodę przesiewową, a nie za ostateczne badanie potwierdzające. Jego celem jest wskazanie, że próbka zawiera sygnał biochemiczny zgodny z materiałem, który może zawierać nasienie. W praktyce laboratoryjnej medycyny sądowej takie badania przesiewowe mogą pomóc w identyfikacji obszarów wymagających dalszej analizy, zmniejszyć liczbę próbek kierowanych do bardziej złożonych analiz oraz szybko zlokalizować potencjalnie istotne ślady biologiczne.

Od niewidocznego enzymu do fioletowego zabarwienia

Test StripDetective wykorzystuje aktywność enzymatyczną fosfatazy kwaśnej, a nie bezpośrednie rozpoznawanie białka PAP za pomocą przeciwciała. Test ten nie wykrywa również samego DNA ani samych plemników. Zamiast tego wykazuje zdolność enzymu do przeprowadzenia określonej reakcji chemicznej. Pierwszym kluczowym składnikiem układu reakcyjnego jest fosforan α-naftylu. Jeśli w próbce występuje wystarczająco wysoka aktywność fosfatazy kwasowej, enzym usuwa grupę fosforanową z tego substratu, wytwarzając α-naftol.

Następnie α-naftol staje się substratem dla drugiego etapu reakcji. Reaguje on z odpowiednią solą diazoniową w reakcji sprzęgania, w wyniku której powstaje barwny związek azowy. Związek ten odpowiada za charakterystyczny fioletowy lub purpurowy kolor pojawiający się w obszarze testowym. Test łączy zatem dwa procesy: reakcję enzymatyczną, po której następuje reakcja chemiczna prowadząca do powstania barwnika. Dzięki tej sekwencji aktywność enzymatyczna, która w przeciwnym razie byłaby niewidoczna gołym okiem, przekształca się w sygnał, który można ocenić wizualnie bez konieczności stosowania specjalistycznej aparatury analitycznej.

Dlaczego wybór fosforanu α-naftylowego ma znaczenie?

Wybór substratu do oznaczenia enzymatycznego nie jest przypadkowy. Substrat powinien być skutecznie rozpoznawany przez enzym, powinien umożliwiać wystarczająco szybką reakcję, powinien wytwarzać produkt, który można łatwo wykryć, oraz powinien zachowywać odpowiednią stabilność w końcowej formulacji. Fosforan α-naftylu jest pod tym względem szczególnie przydatny, ponieważ ludzka fosfataza kwaśna prostaty wchodzi z nim w korzystną interakcję, a powstały α-naftol idealnie nadaje się do reakcji sprzęgania ze związkami diazoniowymi.

W praktyce pozwala to na skuteczne połączenie jednego etapu biochemicznego z drugim etapem chemicznym. W wyniku działania enzymatycznego powstaje najpierw α-naftol, a następnie α-naftol ten ulega przemianie w związek o intensywnym zabarwieniu. Takie połączenie oznacza, że enzym, którego nie da się dostrzec bez użycia specjalistycznego sprzętu, może wytworzyć łatwy do zinterpretowania sygnał widzialny.

Test składa się z więcej niż dwóch związków reaktywnych

Na pierwszy rzut oka cały system może wydawać się prosty: należy połączyć odpowiedni substrat fosfatazy ze związkiem diazoniowym i obserwować, czy pojawia się zabarwienie. W praktyce jednak opracowanie stabilnego i powtarzalnego testu enzymatycznego jest znacznie bardziej złożone. Na aktywność fosfatazy wpływają takie czynniki, jak pH, stężenie odczynników, aktywność wody, temperatura, stabilność substratu oraz obecność innych enzymów lub związków chemicznych mogących zakłócać przebieg reakcji. Każdy z tych czynników może wpłynąć na tempo pojawiania się zabarwienia lub zwiększyć poziom tła oraz reakcje niespecyficzne.


Z tego powodu preparat StripDetective zawiera nie tylko fosforan α-naftylowy i odczynnik diazoniowy. Zawiera on również związki buforujące pH, które pomagają utrzymać środowisko reakcyjne sprzyjające aktywności enzymatycznej; stabilizatory, które zapewniają właściwe działanie odczynników podczas przechowywania; oraz środki ochronne, które pomagają chronić wrażliwe składniki układu reakcyjnego przed degradacją. Preparat zawiera ponadto substancje wzmacniające reakcję, mające na celu zapewnienie szybkiego i wyraźnie widocznego wybarwienia, a także inhibitory niespecyficznej aktywności fosfatazy, zaprojektowane w celu ograniczenia niepożądanych reakcji enzymatycznych i poprawy selektywności całego układu.

Opracowanie odpowiednich proporcji tych składników, optymalizacja warunków reakcji oraz ustalenie odpowiedniego systemu stabilizacji wymagały dwóch lat prac nad recepturą testu StripDetective. Wyzwaniem nie było jedynie wykazanie reakcji fosfatazy kwasowej, ponieważ podstawowe zasady chemiczne tego zjawiska są znane od dziesięcioleci. Celem było stworzenie systemu zdolnego do zachowania stabilności podczas przechowywania, generującego wyraźnie widoczny sygnał w krótkim, określonym czasie oraz ograniczającego wpływ reakcji niespecyficznych w warunkach znacznie odbiegających od kontrolowanego środowiska laboratorium kryminalistycznego.

Dlaczego intensywność koloru może się różnić?

Tempo pojawiania się zabarwienia oraz jego ostateczna intensywność zależą częściowo od aktywności enzymatycznej obecnej w badanej próbce. Gdy aktywność fosfatazy kwasowej jest wysoka, w krótkim czasie może dojść do przekształcenia większej liczby cząsteczek substratu w α-naftol, co prowadzi do szybszego i wyraźniejszego tworzenia się zabarwionego produktu. Przy niższym poziomie aktywności enzymatycznej reakcja może być odpowiednio słabsza. Zależność ta wyjaśnia, dlaczego różne próbki mogą wykazywać różny stopień intensywności zabarwienia.

Intensywność koloru nie powinna być jednak interpretowana jako precyzyjny pomiar ilościowy obecnej ilości nasienia. StripDetective jest testem raczej jakościowym niż ilościowym, a na wygląd reakcji wpływa nie tylko pierwotna ilość obecnego enzymu. Na uzyskany kolor mogą wpływać: ilość pobranego materiału, stopień rozcieńczenia próbki, wiek i stan śladu, skuteczność przeniesienia próbki, charakter badanej powierzchni oraz sposób przeprowadzenia procedury. Z tego powodu wynik należy interpretować w określonym czasie odczytu oraz poprzez porównanie z odpowiednią skalą odniesienia, a nie wykorzystywać go do oszacowania ilości materiału nasiennego.

Dlaczego wynik pozytywny nadal ma charakter wstępny?

Najważniejszą zasadą odpowiedzialnej interpretacji wyniku badania jest świadomość, że fosfataza kwaśna nie występuje wyłącznie w nasieniu. Aktywność fosfatazy można wykryć również w innych tkankach i materiałach biologicznych, choć zazwyczaj na znacznie niższym poziomie. Dlatego też dodatni wynik reakcji chemicznej wskazuje jedynie na wykrycie aktywności enzymatycznej powyżej określonego progu; nie pozwala to bezpośrednio zidentyfikować cząsteczki występującej wyłącznie w płynie nasiennym. Z tego powodu badania na obecność fosfatazy kwaśnej klasyfikuje się jako badania orientacyjne.

Wstępny wynik pozytywny wskazuje, że badany ślad może zawierać nasienie i może uzasadniać przeprowadzenie dalszych badań, jednak sam w sobie nie stanowi ostatecznego potwierdzenia. W przypadku konieczności uzyskania ostatecznej identyfikacji materiał należy zbadać przy użyciu odpowiednich metod laboratoryjnych. Jeśli celem jest dodatkowo ustalenie tożsamości osoby, od której pochodzi materiał biologiczny, konieczna jest analiza DNA. Metody te dostarczają informacji na różnych poziomach, odpowiadając na różne pytania naukowe, i nie należy ich traktować jako zamiennych.

Co oznacza wynik ujemny?

Wynik ujemny również wymaga odpowiedniej interpretacji. Oznacza on, że w pobranej i zbadanej próbce nie wykryto aktywności fosfatazy kwaśnej powyżej progu reakcji określonego w teście. Nie należy go jednak interpretować jako absolutnego dowodu biologicznego na to, że w badanym miejscu nigdy nie występowało nasienie, ponieważ możliwość wykrycia aktywności enzymatycznej zależy od wielu czynników związanych z samą próbką oraz sposobem jej pobrania.

Bardzo mała ilość materiału biologicznego, znaczne rozcieńczenie, degradacja enzymatyczna, nieefektywne przeniesienie próbki, nierównomierny rozkład śladu lub obecność substancji zakłócających aktywność enzymatyczną – wszystkie te czynniki mogą osłabić reakcję. Jest to kolejny powód, dla którego kryminalistyka wyraźnie rozróżnia badania przesiewowe od badań potwierdzających. Badanie wstępne pomaga w podjęciu decyzji dotyczących dalszej analizy, ale nie może zastąpić wszystkich kolejnych etapów badań laboratoryjnych.

Od biologii pojedynczego białka do narzędzia analitycznego

Kwaśna fosfataza prostaty stanowi doskonały przykład tego, w jaki sposób wiedza na temat budowy i funkcji pojedynczego białka może zostać przełożona na praktyczny system analityczny. Znamy lokalizację genu kodującego to białko, jego sekwencję aminokwasową, architekturę jego struktury dimerowej, miejsca glikozylacji oraz budowę jego centrum aktywnym. Wiemy, że enzym ten należy do rodziny fosfataz kwasowych histydynowych oraz że w procesie katalizy dochodzi do przejściowego tworzenia się pośredniego związku fosfohistydynowego. Wiemy również, że enzym ten może oddziaływać na szeroki zakres substratów oraz że może uczestniczyć w kilku różnych procesach metabolicznych zachodzących w płynie nasiennym.

Jednocześnie istotne pytania dotyczące jego roli fizjologicznej pozostają bez odpowiedzi. PAP najprawdopodobniej bierze udział jednocześnie w metabolizmie takich związków, jak fosfocholina, LPA i AMP, i może w ten sposób wpływać na środowisko biochemiczne osocza nasiennego, a potencjalnie także na funkcjonowanie plemników. Z punktu widzenia medycyny sądowej jedna cecha pozostaje jednak nadrzędna: płyn nasienny charakteryzuje się wyjątkowo wysoką aktywnością fosfatazy kwasowej w porównaniu z większością innych materiałów biologicznych. To właśnie ta różnica sprawia, że enzym ten stanowi cenny marker biochemiczny o charakterze poszlakowym.

Test StripDetective opiera się na tej samej podstawowej zasadzie biochemicznej. Aktywność fosfatazy kwaśnej powoduje hydrolizę starannie dobranego substratu, w wyniku czego powstaje α-naftol, który następnie bierze udział w reakcji prowadzącej do powstania widocznego produktu o fioletowym zabarwieniu. Cały system ilustruje jedną z podstawowych zasad analizy biochemicznej: nie zawsze konieczne jest bezpośrednie wykrycie cząsteczki, jeśli charakterystyczną reakcję katalizowaną przez tę cząsteczkę można zaobserwować z wystarczającą czułością i wyrazistością. Jest to zasada naukowa leżąca u podstaw testu StripDetective.

Bibliografia


Kaye S. Badanie fosfatazy kwasowej w celu identyfikacji plam nasiennych. „Journal of Laboratory and Clinical Medicine”.
1949;34(5):728–732. PMID: 18127788.

Kind SS. Stabilne testy do oznaczania fosfatazy kwasowej nasienia. Nature. 1958;182:1372–1373. doi:10.1038/1821372b0.

Lin MF, Lee CL, Wojcieszyn JW, Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. Podstawowe aspekty biochemiczne i immunologiczne fosfatazy kwaśnej gruczołu krokowego. The Prostate. 1980;1(4):415–425. doi:10.1002/pros.2990010405.

Vihko P, Virkkunen P, Henttu P, Roiko K, Solin T, Huhtala ML. Klonowanie molekularne i analiza sekwencji cDNA kodującego ludzką fosfatazę kwaśną gruczołu krokowego. FEBS Letters. 1988;236(2):275–281. doi:10.1016/0014-5793(88)80037-1.

Jakob CG, Lewinski K, Kuciel R, Ostrowski W, Lebioda L. Struktura krystaliczna ludzkiej fosfatazy kwaśnej prostaty. The Prostate. 2000;42(3):211–218. doi:10.1002/(SICI)1097-0045(20000215)42:3<211::AID-PROS7>3.0.CO;2-U.

Ortlund E, LaCount MW, Lebioda L. Struktury krystaliczne ludzkiej fosfatazy kwaśnej gruczołu krokowego w kompleksie z jonem fosforanowym i kwasem α-benzyloaminobenzylofosfonowym uzupełniają obraz mechanizmu działania i dostarczają nowych spostrzeżeń dotyczących projektowania inhibitorów.
Biochemistry. 2003;42(2):383–389. doi:10.1021/bi0265067.


Sharma S, Rauk A, Juffer AH. Badanie metodą DFT dotyczące powstawania pośredniego związku fosfohistydynowego w fosfatazie kwasowej gruczołu krokowego.
Journal of the American Chemical Society. 2008;130(30):9708–9716. doi:10.1021/ja710047a.

Muniyan S, Chaturvedi NK, Dwyer JG, LaGrange CA, Chaney WG, Lin MF. Ludzka fosfataza kwaśna gruczołu krokowego: budowa, funkcja i regulacja. International Journal of Molecular Sciences. 2013;14(5):10438–10464. doi:10.3390/ijms140510438.

Liu X, Yu L, Xia Z, Li J, Meng W, Min L, Li F, Wang X. Oczyszczanie, identyfikacja oraz struktura fosfatazy kwaśnej prostaty w ludzkim nasieniu określona metodą kriomikroskopii elektronowej. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2024;702:149652. doi:10.1016/j.bbrc.2024.149652.

Luchter-Wasylewska E. Kinetyka kooperacyjna ludzkiej fosfatazy kwaśnej prostaty. Biochimica et Biophysica Acta. 2001;1548(2):257–264. doi:10.1016/S0167-4838(01)00239-4.

Bowers JL, Bowers GN Jr. Fosforan 1-naftylu: specyfikacje wysokiej jakości substratu do pomiaru aktywności fosfatazy kwaśnej prostaty. Clinical Chemistry. 1982;28(1):212–215. doi:10.1093/clinchem/28.1.212.

Tanaka M, Kishi Y, Takanezawa Y, Kakehi Y, Aoki J, Arai H. Fosfataza kwaśna prostaty rozkłada kwas lizofosfatydowy w osoczu nasiennym. FEBS Letters. 2004;571(1–3):197–204. doi:10.1016/j.febslet.2004.06.083.

Zylka MJ, Sowa NA, Taylor-Blake B i in. Fosfataza kwaśna gruczołu krokowego jest ektonukleotydazą i hamuje ból poprzez wytwarzanie adenozyny. Neuron. 2008;60(1):111–122. doi:10.1016/j.neuron.2008.08.024.

Hanley PJ. Trudna do określenia rola fizjologiczna fosfatazy kwasowej gruczołu krokowego (PAP): wytwarzanie choliny niezbędnej do ruchliwości plemników poprzez auto- i parakrynne sygnalizowanie cholinergiczne. Frontiers in Physiology. 2023;14:1327769. doi:10.3389/fphys.2023.1327769.


Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej. ACP3 – fosfataza kwaśna 3 [Homo sapiens]. NCBI Gene, identyfikator genu: 55. Aktualna lokalizacja cytogenetyczna: 3q22.1.